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siRNA轉(zhuǎn)染實驗步驟及實驗原理

更新時間:2024-09-27      點擊次數(shù):882


siRNA是目前基礎(chǔ)研究中常用的基因沉默(基因干擾)形式之一,方便快捷,在各種真核生物的基因功能研究,藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。常規(guī)siRNA產(chǎn)品為凍干粉形式的即用型試劑,-20°保存。進行特異性靶點設(shè)計,覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因,借助化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)適合進行各種細胞RNAi實驗。此外,通過對siRNA進行特殊化學(xué)修飾,可以實現(xiàn)在體內(nèi)實驗更加高效、特異、穩(wěn)定。

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siRNA轉(zhuǎn)染原理

siRNA在細胞中降解mRNA的機制與miRNA類似(如上圖),合成的siRNA通過胞吞進入細胞中,隨后少量的 siRNA 能夠發(fā)生溶酶體逃逸進入細胞質(zhì),進入細胞質(zhì)后siRNA與 Dicer 及 TRBP 形成 RISC復(fù)合物,RISC復(fù)合物招募 AGO2,隨后正義鏈被降解,siRNA 反義鏈與互補配對的 mRNA 序列結(jié)合,接著 AGO2 對mRNA 進行切割,最終引起 mRNA 的降解。

siRNA轉(zhuǎn)染實驗步驟(下面以 24 孔板為例,其他培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染可以咨詢李記生物)

1、接種細胞

   對于貼壁細胞:轉(zhuǎn)染前一天,將細胞按照每孔1-2x10^5個細胞的量進行鋪板,使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-80% 為佳。

   對于懸浮細胞:轉(zhuǎn)染當(dāng)天,配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,用PBS清洗細胞1-2次,用250 μL Opti-MEM I 減血清培養(yǎng)基 (無血清) 重懸細胞,在24孔板中進行細胞鋪板,細胞密度為60-80%。

2、準備轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物(或轉(zhuǎn)染試劑-miRNA復(fù)合物)

   (1)對于每孔細胞,取2 μLsiRNA (20 μM,DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中,加入2 μL轉(zhuǎn)染試劑與siRNA 混合,室溫孵育3 min。

   (2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清),輕輕混勻,在室溫下靜置30 min,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

   (3)30 min后,往上述復(fù)合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清),輕輕混勻。

3、轉(zhuǎn)染細胞

   (1)細胞用PBS清洗1-2次,將上述350µL轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物加入每孔細胞。

   (2)在 37℃,5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-48 h,無需更換新的培養(yǎng)液,之后即可檢測基因干擾效果或者后續(xù)功能實驗。注:可在轉(zhuǎn)染12h后補充500 μL培養(yǎng)基。

siRNA轉(zhuǎn)染效率驗證

siRNA沉默效果分析siRNA 轉(zhuǎn)染細胞后,siRNA 在  細胞內(nèi)一系列酶的作用下形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物,識別并切割靶基因mRNA,誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應(yīng), 從而抑制了細胞內(nèi)目的基因蛋白的表達,一般可從兩個方面進行檢測。

 • mRNA 水平 - QPCR檢測

  siRNA的作用機理在于其引起靶基因mRNA的降解,因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明。一般在siRNA轉(zhuǎn)染后24小時后即可檢測到靶mRNA水平的降低,可采用細胞總RNA提取,全長cDNA合成,熒光定量實驗即可檢測到mRNA 的敲除效率。

 • 蛋白水平 - WB檢測

  siRNA引起靶基因mRNA的降解,從而影響了靶蛋白的表達。但蛋白水平檢測時間受細胞內(nèi)目的蛋白表達量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調(diào)控等因素的影響,蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關(guān)系。一般在轉(zhuǎn)染后48后開始WB檢測,72,96 小時,甚至更長時間之后多點采樣。


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